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    常用的酶聯免疫吸附實驗原理有哪些?
    發布時間:2018/11/7 8:47:07 閱讀次數:2134

     酶聯免疫吸附實驗,一般簡稱為Elisa。Elisa技術是免疫標記技術的一種,因為具有快速,方便,簡單,定性,定量甚至定位的特點,廣泛應用于廣大科研實驗中。下面我們來介紹下常用的幾種實驗原理。

    1, 競爭法

    競爭法一般分為直接競爭法和間接競爭法。間接競爭法在常見的實驗中用的不是很多,

    我們就主要介紹一下直接競爭法的原理。直接競爭法就是將合適的包被抗體包被于微孔板中,

    加入無關蛋白載體封閉未結合的位點,然后加入標準品(樣本)和生物素標記的抗原物質進行競爭結合,在合適的溫度和一定時間的孵育,洗滌,再加入HRP標記的鏈霉親和素來進行反應,TMB顯色,微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈負相關。
      這個方法一般多用來檢測具有較少表位的小分子物質。檢測大分子抗原物質及抗體時,這種方法也可以用。但是檢測大分子抗原時,由于空間位阻的影響,使得該檢測方法沒有雙抗體夾心法檢測大分子抗原物質靈敏度高;檢測抗體時,可能由于兩種競爭的抗體來源不一,導致兩種抗體趨同性不高,就會造成檢測結果的可靠性不高。

    2, 間接法

    間接法一般用來檢測抗體。間接法是將一定量的抗原物包被于聚苯乙烯微孔板中,加入無關蛋白載體封閉未結合位點后,加入待測樣本,然后加入酶標二抗,過一定的時間孵育和洗滌后,加底物顯色。一般而言,在間接法檢測抗體實驗中,由于酶標二抗的局限性,一般檢測的抗體為總的IgG。

    3, 雙抗體夾心法

    雙抗體夾心法,它是將一定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面,加入無關蛋白載體封閉未結合位點,然后加入待測標本,通過加入檢測抗體,酶標記第二抗體后用TMB底物顯色,待測物的濃度與微孔板中顏色的深淺呈正相關。
      雙抗體夾心法多用于含有多個抗原表位的大分子物質。因為此檢測方法需要兩種抗體,所以就關系到抗體配對的問題。一般常用的抗體配對方法有下面幾種:包被抗體為單抗,檢測抗體為單抗,但這兩種單抗針對的抗原表位不同;包被抗體為單抗,檢測抗體為多抗;包被抗體為多抗,檢測抗體為多抗,這兩種多抗一般是來源于不同的宿主。

      雙抗體夾心法在應用酶標第二抗體時,要注意一個關鍵是:第二抗體必須只能針對檢測抗體,而不能針對包被抗體。由于酶標二抗具有局限性,現在一般廠家都引入生物素親和素放大系統,這種系統不僅能提高反應靈敏度,而且也更加方便,我們只需對檢測抗體進行生物素標記,不需要對每一種不同來源的二抗進行酶標記,只需對親和素做HRP標記就可以省去很多麻煩的工作。

    4, 雙抗原夾心法

    雙抗原夾心法,與雙抗體夾心法類似,基本原理是將已知濃度的抗原固定于聚苯乙烯微孔板表面,對未結合位點用無關蛋白載體進行封閉后,加入待測樣本,然后加入生物素標記的抗原和HRP標記的鏈霉親和素,經TMB顯色后終止反應,酶標儀讀數之后即可計算待測物濃度。雙抗原夾心法與間接法都可以對抗體進行檢測,但是前者檢測的是針對該抗原的所有種類的抗體,包含IgG, IgM, IgA,IgD, IgE,這是間接法做不到的。

     

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